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    標題: 含有NADPH的藍色螢光蛋白突變與X光晶體結構分析
    作者: 黃文珊
    陳俊榮
    貢獻者: 嘉南藥理大學醫藥化學系
    國立成功大學生物科技研究所&國家同步輻射研究中心生命科學小組
    關鍵字: NADPH-dependent fluorescent protein
    Blue fluorescent protein
    Short chain dehydrogenase/reductase
    X-ray crystallography
    Site directed mutagenesis
    日期: 2016-05-10
    上傳時間: 2018-05-21 10:35:25 (UTC+8)
    摘要: 關於創傷弧菌CKM-1 基因中選殖出來的藍色螢光蛋白研究已進行了一段時間。藍色螢光蛋白(BFPvv)的基因已藉由分子複製技術選殖出來,重組蛋白利用大腸桿菌系統表現。在近幾年的研究中指出對重組蛋白BFPvvD7(八個突變位點)和BFPvvD8(十一個突變位點)兩種多點突變BFPvv 比野生型藍色螢光蛋白(WT-BFPvv)大幅提升螢光強度;而將176位點的甘胺酸(Gly)突變成絲胺酸(Ser)後對螢光亮度的提升亦有顯著的影響。此外,由晶體結構中顯示將199位點的離胺酸(Lys)突變成精氨酸(Arg)後,將使突變之精氨酸的側鏈殘基(side chain)較離胺酸的side chain 更接近輔因子菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氫(NADPH)分子,推論結構的改變可能是影響發光強度的因素。
    為了要瞭解突變位點如何影響螢光強度, 我建構了一個雙點突變的Gly176Ser/Lys199Arg BFPvv 流程,大量表現蛋白並加入輔因子NADPH 使其與蛋白分子形成複合體後,進而培養出蛋白質晶體。在此雙點突變蛋白序列中加入六個組胺酸(His)作為標記蛋白,並在大腸桿菌BL21(DE3)中大量表現,藉由鎳離子親和性管柱及膠體過濾層析管柱純化蛋白樣品,再以懸滴蒸氣擴散式的結晶方法培養蛋白質晶體,此雙點突變蛋白質晶體由同步輻射X-光繞射實驗得到2.3A解析度的電子密度圖。G176S/K199R BFPvv 晶體屬四方晶系,空間群為P43212,在不對稱晶格單元中含有兩個蛋白分子,預估含52.78%的溶劑含量。目前我正著手於對G176S/K199R BFPvv 結構的分析,試圖找出影響螢光強度的原因,並與WT-BFPvv 做比較。而未來將利用螢光光譜儀分析此G176S/K199R BFPvv 和WT-BFPvv 其螢光激發強度,來佐證結構上的差異性與螢光強度所呈現的關係。
    關聯: 2016 第十屆嘉南藥理大學藥理學院師生研究成果發表會,起迄日:2016/05/10-2016/05/13,地點:嘉南藥理大學國際會議中心一樓
    顯示於類別:[食藥產業暨檢測科技系(含五專)] 會議論文
    [藥理學院] 2016 第十屆嘉南藥理大學藥理學院師生研究成果發表會

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